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基因編輯類型
根據研究的不同目的，需要制備不同的的動物模型。當為了研究基因的功能時需要過表達或敲除相應基因。如果全身敲除目的基因會導致動物死亡時，或需要在特定的組織敲除基因時，可以制備條件敲除小鼠。為了建立基因突變模型時，制備點突變動物模型。制備基因人源化小鼠時，可以進行人源基因的替換。制備不同的動物模型，需采用相應的策略，才能成功獲得目標模型。
基因敲除是研究基因功能的重要方法。傳統ES打靶敲除方法，周期長，費用高。CRISPR/Cas9在基因敲除方面的優勢：效率高，時間短，24天直接獲得基因敲除小鼠。
技術一般的流程
設計合成gRNA→ 顯微注射→ 小鼠出生檢測。
技術優勢或適合應用的研究
-效率高，可達90%的敲除效率，并且有一定純合敲除比例。
-方便檢測，從PCR條帶的大小，容易區分是否發生敲除。
-時間短，24天獲得基因敲除小鼠。
-不受敲除片段大小限制，從幾十bp到Mb長度的DNA,都能有效敲除。
成功案例
圖1：兩個Grna切割位點之間的~550bp基因序列被敲除，PCR檢測，相對于野生帶773bp，發生敲除的鼠產生~220bp的條帶（箭頭指向的條帶）。
當基因敲除會導致小鼠死亡時，需要條件敲除，才能獲得成體小鼠用于研究。條件敲除一般使用Cre-loxp系統，其方法是在基因的關鍵區域的兩側，插入loxp。loxp小鼠制備好后，與Cre小鼠雜交，獲得loxp純合，Cre陽性的小鼠，這種小鼠在Cre的作用下，loxp發生重組，中間的序列被刪除，達到敲除基因的目的。目前已經有數百種Cre工具小鼠，可以根據研究需要，購買或定制Cre工具鼠，在不同的組織器官，達到敲除目的基因。Cre融合ER/ERT2后，可以使用tamoxifen調控Cre入核，實現時間上的調控刪除。
圖1：通過CRISPR輔助，在關鍵外顯子的兩側通過同源重組，插入兩個loxp，在Cre的作用下，loxp之間的外顯子被刪除，實現基因條件敲除。
技術一般的流程
打靶載體設計→ 載體構建→ 顯微注射(EPS打靶)→ 小鼠鑒定。
技術優勢或適合應用的研究
-用于敲除致死的基因
-非致死基因，用條件敲除也可以在不同的組織，不同的時間敲除基因，獲得更多的實驗數據。
成功案例
圖2：在關鍵外顯子或非3整數倍的外顯子兩側敲入loxp,在Cre的作用下，該區域被刪除，導致基因敲除。
圖3：設計Loxp插入位點的特異引物與同源臂外側的引物，通過PCR，可以檢測到兩個loxp被正確敲入到目的位置，證明獲得條件敲除小鼠。
隨機轉基因是一種經典的過表達基因小鼠制備策略，不同于靶向基因編輯，沒有受到新興基因編輯技術的影響。該方法通過將基因隨機整合到基因組中，實現目的基因過表達。
技術一般的流程
過表達載體構建→ 顯微注射→ 小鼠鑒定篩選→ 表達檢測→ 品系建立。
圖1：轉基因載體和小鼠制備流程。
技術優勢或適合應用的研究
-可以廣譜，或組織特異過表達目的基因。
-多拷貝插入，比定點插入表達量更高。
-受整合位置影響，可能表達沉默，或者表達譜錯誤。
成功案例
圖2：通過轉基因載體特異的引物設計，檢測到轉基因陽性的小鼠，一般效率在10-20%。
定點轉基因是將轉基因表達載體敲入到Rosa26位點，該位點被證明是在所有組織細胞都活躍的區域，不會發生隨機轉基因中出現的轉基因沉默的現象。常用來制作過表達或條件過表達小鼠。條件過表達是在目的基因前面插入loxp包圍的Stop序列，阻止目的基因表達。該小鼠模型與Cre小鼠雜交，能夠在Cre表達的組織中，刪除Stop序列，從而使目的基因發生表達；過表達小鼠直接獲得組成性基因表達小鼠。維通達的Rosa26位點的定點轉基因系統，已經實現長達10kb的定點轉基因。
圖1：Rosa26位置敲入轉基因表達載體，制備定點轉基因小鼠.
基因敲入是指在基因組的特定位置插入一段DNA序列，例如給基因加GFP熒光標簽標記蛋白，原位敲入制備Cre工具鼠等應用。1kb以下的小片段插入，CRISPR/Cas9效率較高。對于大片段的基因插入，需要使用ES，或者EPS制備策略才能保證項目周期和效率。
圖1：把綠色熒光蛋白敲入目的基因的C端，融合表達，示蹤目的基因。
技術一般的流程+圖解
打靶載體設計→ 載體構建→ 顯微注射(EPS打靶)→ 小鼠鑒定。
技術優勢或適合應用的研究
-CRISPR用于小片段的基因敲入。
-ES/EPS用于大片段基因敲入。
-給基因加各種標簽，原位敲入制備Cre工具鼠。
基因替換指，根據研究需要，將小鼠的基因替換為其它物種的基因?？梢詫⒒虻牟糠止δ軈^，或者全基因進行替換。1kb以下的小片段替換，可以采用CRISPR/Cas9策略。對于大片段的基因替換，需要使用ES，或者EPS制備策略才能成功。
圖1：用其它種系的基因，替換小鼠的基因片段。
技術一般的流程+圖解
打靶載體設計→ 載體構建→ 顯微注射(EPS打靶)→ 小鼠鑒定。
技術優勢或適合應用的研究
-CRISPR用于小片段的基因替換。
-ES/EPS用于大片段基因替換。
3)基因人源化小鼠的制備，如PD1等免疫檢查點人源化小鼠的制備。
圖1 EPS小片段敲入效率高達90%。
圖2 EPS系統對于長達20kb的大片段敲入，也具有很高的效率。
許多疾病由氨基酸突變引起，為了構建此類疾病模型，可以將小鼠的對應基因的位點進行突變。單鏈DNA在點突變方面有較高的成功率。
圖1 單鏈DNA模板制備點突變小鼠。
圖2 PCR擴增包含突變位點的序列，測序檢測發生點突變的小鼠，目標堿基出現套峰，證明獲得雜合突變小鼠。
技術一般的流程
gRNA設計→ 供體DNA合成→ 顯微注射(EPS打靶)→ 小鼠鑒定。
技術優勢或適合應用的研究
-氨基酸突變類小鼠疾病模型模擬
-CRISPR點突變效率相對較高
